Source: https://people.csail.mit.edu/seneff/does_glyphosate_substitute.html

od Stephanie Seneff

Nedavno su objavili rad Antoniou i sur. s podebljanim naslovom, “Glifosat ne zamjenjuje glicin u proteinima stanica sisavaca koji se aktivno dijele.” [1]. Rad je uključivao izlaganje ljudskih stanica raka dojke glifosatu tijekom šest dana, a zatim korištenje sofisticirane tehnike zvane Tandem oznaka mase (TMT) za označavanje kratkih peptida koji navodno sadrže anomalno teške molekule glicina. Proteini iz tretiranih i netretiranih stanica prošli su standardni protokol koji je uključivao masenu spektrometriju, djelomičnu proteolizu i daljnju analizu, kao što je detaljno opisano u radu.

Stanice su održavane na bogatoj nutritivnoj formulaciji zvanoj Dulbecco’s Modified Eagle Medium. Ova formulacija je modifikacija originalnog Basal Medium Eaglea koji je četverostruko obogaćen aminokiselinama i vitaminima. Također ima visoku koncentraciju glukoze od 4500 mg/L. Nema jamstva da nije kontaminiran glifosatom. Nadalje, stanice su uzgajane u kulturi neko neodređeno vrijeme u prošlosti i vjerojatno su nakupile znatan broj pogrešno savijenih proteina kontaminiranih glifosatom koje je bilo teško očistiti. Vjerojatno su započeli svoj život u kulturi već s proteinima kontaminiranim glifosatom, kroz doživotnu izloženost glifosatu čovjeka koji je izvorno sadržavao te stanice u tumoru dojke.

Autori su testirali uzorke na dvije različite posttranslacijske modifikacije (PTM): glioksilatom modificirani cistein i glifosatnu supstituciju za glicin. Uključili su modifikaciju glioksilata jer su pretpostavili da bi se glifosat mogao razgraditi do glioksilata, koji je sposoban vezati se za ostatke cisteina. Primjetno, nisu otkrili cisteine ​​modificirane glioksilatom ni u kontrolnim ni u tretiranim stanicama.

Nasuprot tome, autori su pronašli značajan signal prisutnosti glifosata u nekoliko kratkih peptida u obrađenim uzorcima. Međutim, također su pronašli jednako jak signal u netretiranim uzorcima. Napisali su: “U ovom eksperimentu, međutim, ne bi se očekivalo da će niti jedan od dva navodna PTM-a (post-translacijske modifikacije) od interesa biti prisutan u nedostatku tretmana glifosatom. Stoga je bilo moguće koristiti TMT označavanje za identificiranje i filtriranje svih potencijalnih lažnih otkrića.” A zatim: “Podaci uvjerljivo pokazuju da su svi kandidati zamijenjeni peptidi lažna otkrića.”

Jednako vjerojatan argument, međutim, je da “netretirane” stanice također sadrže proteine ​​supstituirane glifosatom. Potencijalno, većina, ako ne i svi kandidati supstituirani peptidi su prava otkrića. Budući da su i tretirane i kontrolne stanice bile izložene glifosatu dulje vrijeme u prošlosti, vjerojatno je da su obje nakupile glifosatom kontaminirane proteine ​​u gotovo jednakim količinama. Anthony Samsel i ja raspravljali smo u našem prvom radu o zamjeni glicina glifosatom o dokazima da N-supstituirani glicini mogu tvoriti peptoide koje je vrlo teško razgraditi, te da je pokazano da fosfonati posjeduju sposobnost inhibicije proteolize [2].

Ideju da izlaganje glifosatu rezultira nakupljanjem proteina otpornih na proteolizu podržava studija objavljena 2013. na biljkama graška [3]. Autori su uočili nakupljanje ubikvitiniranih proteina zajedno s povećanjem enzima proteolize, što je iznenađujuće i neobično. Napisali su:

“Akumulacija ubikvitiniranih proteina, zajedno s povećanom navodnom aktivnošću proteasoma, uočena je kroz ABPP [Profiliranje aktivnosti na temelju proteina], što ukazuje na ulogu proteasoma nakon tretmana herbicidom. Akumulacija ubikvitiniranih proteina tipično je opisana u vezi s istodobnim smanjenjem aktivnosti proteasoma. Ipak, naši su rezultati pokazali povećanje razine i aktivnosti proteasomskog supstrata. Stoga, herbicidima inducirani stres na proteomu može rezultirati nakupljanjem ubikvitiniranih proteina, unatoč povećanoj aktivnosti proteasoma, ili povećana dostupnost supstrata može potaknuti aktivnost proteasoma.

Vjerojatno objašnjenje je da glifosat ugrađen u proteine ​​remeti sposobnost proteolitičkih enzima da ga razgrađuju. Zapravo, u radu koji povezuje glifosat s amiotrofičnom lateralnom sklerozom (ALS), opisali smo kako bi glifosat mogao poremetiti sam proces ubikvitinacije, koji označava proteine ​​za brisanje proteasomom [4]. Napisali smo:

“Najintrigantnija je činjenica da sam ubikvitin kritično ovisi o visoko konzerviranom karboksi terminalnom paru dvostrukog glicina za izgradnju složenih ubikvitinskih lanaca koji signaliziraju razgradnju proteina[46] [reproduciranog ovdje kao [5]]. Očekuje se da će zamjena glifosata za bilo koji od ovih esencijalnih glicina narušiti proces recikliranja pogrešno savijenih proteina. To bi lako moglo objasniti nakupljanje pogrešno savijenih proteina što je obilježje ALS-a.”

Na našu sreću, Antoniou i sur. [1] dali su u svojoj tablici 3 točne sekvence s glifosatnim zamjenama koje su otkrivene, a web stranica Uniprot pruža alat na kojem se mogu pronaći proteini koji sadrže specifične sekvence, koristeći softverski paket nazvan BLAST. Uniprot je uspio dohvatiti identitet svih 15 proteina danih kao pogodak na njihovoj slici 3, s točnim podudaranjem sa sekvencom prisutnom unutar svakog proteina. Svih 15 proteina bili su ljudski proteini. Najmanje devet od ovih proteina veže se na molekule koje sadrže fosfate, kao što je nabrojano u Tablici 1. To pruža potporu ideji da su proteini koji vežu fosfat posebno osjetljivi na zamjenu glifosata, kao što je artikulirano u nedavnom radu koji su objavili Gunatilake et al. [6], predlažući da je glifosat glavni čimbenik kronične bolesti bubrega nepoznate etiologije (CKDu) među poljoprivrednim radnicima u Šri Lanki. Zapravo, protein EPSP sintaza u biljkama za koji se vjeruje da je glavna meta glifosata u ubijanju korova, sadrži visoko konzervirani ostatak glicina na mjestu gdje se veže fosfoenol piruvat (PEP). Istraživači iz DowDuponta uspjeli su upotrijebiti CRISPR tehnologiju za stvaranje soja kukuruza koji je otporan na glifosat, zbog CRISPR-modificiranog gena za EPSP sintazu [7]. Prvi korak koji su učinili je promjena DNK koda kako bi zamijenili glicin na mjestu vezanja PEP alaninom. To je rezultiralo verzijom enzima koja je bila potpuno neosjetljiva na glifosat. protein EPSP sintaza u biljkama za koju se vjeruje da je glavna meta glifosata u uništavanju korova, sadrži visoko konzervirani ostatak glicina na mjestu gdje se veže fosfoenol piruvat (PEP). Istraživači iz DowDuponta uspjeli su upotrijebiti CRISPR tehnologiju za stvaranje soja kukuruza koji je otporan na glifosat, zbog CRISPR-modificiranog gena za EPSP sintazu [7]. Prvi korak koji su učinili je promjena DNK koda kako bi zamijenili glicin na mjestu vezanja PEP alaninom. To je rezultiralo verzijom enzima koja je bila potpuno neosjetljiva na glifosat. protein EPSP sintaza u biljkama za koju se vjeruje da je glavna meta glifosata u uništavanju korova, sadrži visoko konzervirani ostatak glicina na mjestu gdje se veže fosfoenol piruvat (PEP). Istraživači iz DowDuponta uspjeli su upotrijebiti CRISPR tehnologiju za stvaranje soja kukuruza koji je otporan na glifosat, zbog CRISPR-modificiranog gena za EPSP sintazu [7]. Prvi korak koji su učinili je promjena DNK koda kako bi zamijenili glicin na mjestu vezanja PEP alaninom. To je rezultiralo verzijom enzima koja je bila potpuno neosjetljiva na glifosat. Istraživači iz DowDuponta uspjeli su upotrijebiti CRISPR tehnologiju za stvaranje soja kukuruza koji je otporan na glifosat, zbog CRISPR-modificiranog gena za EPSP sintazu [7]. Prvi korak koji su učinili je promjena DNK koda kako bi zamijenili glicin na mjestu vezanja PEP alaninom. To je rezultiralo verzijom enzima koja je bila potpuno neosjetljiva na glifosat. Istraživači iz DowDuponta uspjeli su upotrijebiti CRISPR tehnologiju za stvaranje soja kukuruza koji je otporan na glifosat, zbog CRISPR-modificiranog gena za EPSP sintazu [7]. Prvi korak koji su učinili je promjena DNK koda kako bi zamijenili glicin na mjestu vezanja PEP alaninom. To je rezultiralo verzijom enzima koja je bila potpuno neosjetljiva na glifosat.

Tablica 1: Devet proteina koji sadrže glifosatom supstituirane peptide, kako je identificirano pomoću spektrometrijskih alata Tandem oznaka mase (TMT). Ovi peptidi, zajedno s još 6, pronađeni su u stanicama raka uzgojenim u kulturi. Svih devet se veže za molekule koje sadrže fosfate kao što je naznačeno u trećem stupcu. Prvi stupac daje otkriveni slijed, gdje “*” označava ostatak glicina za koji je utvrđeno da je supstituiran. Vidi: Antoniou i sur. (2019) za detalje o eksperimentalnoj postavci.

Sveukupno, tablica 1 otkriva intrigantan popis ljudskih proteina, a za mnoge od njih bi se očekivalo da će biti izraženi u stanicama raka dojke. Na primjer, jedan je protein metilacije RNA (tRNA (homolog gvanin(10)-N2)-metiltransferaze). Drugi ima funkciju supresora tumora kroz inhibiciju Akt, vezanjem na fosfatidilinozitol fosfate (član obitelji A 5 koji sadrži domenu homologije Pleckstrina). Drugi je receptor povezan s G-proteinom (GPCR). Prema Bar-Shavitu i sur., “GPCR kontroliraju mnoge značajke tumorigeneze, uključujući funkcije posredovane imunološkim stanicama, proliferaciju, invaziju i preživljavanje na sekundarnom mjestu.” [8] Još jedan hit je homeobox protein, a vjeruje se da ova klasa proteina igra uzročnu ulogu u raku dojke [9].

Još jedno važno otkriće iz ovog rada su dva proteina za koje je utvrđeno da su statistički značajno povećane kao odgovor na šestodnevni tretman glifosatom. To su: ADP/ATP nukleotidna translokaza (ANT) i faktor spajanja bogat serin/arginin 6 (SRSF6) [1]. Pokazalo se da su ova dva proteina vrlo zanimljiva, jer je poznato da su oba prekomjerno izražena u tumorskim stanicama, a u oba slučaja više razine tih proteina povezane su s lošim ishodom kod pacijenata s rakom.

SRSF6 je član obitelji čimbenika spajanja koji imaju moćne sposobnosti da mijenjaju ekspresiju proteina, mijenjajući način na koji se peptidi sastavljaju iz pojedinačnih egzona. Prekomjerna ekspresija SRSF6 u epitelnim stanicama pluća pojačala je proliferaciju, zaštitila ih od kemoterapije i povećala njihovu sposobnost stvaranja tumora [10]. Nadalje, uništavanje SRSF6 u staničnim linijama raka pluća i debelog crijeva smanjilo je njihov tumorogeni potencijal. SRSF6 se često eksprimira kod raka kože i mijenja spajanje proteina zvanog tenascin C kako bi potaknuo invazivni i metastatski rak [11]. SRSF6 također uzrokuje prekomjernu proliferaciju keratinocita, karakterističnu značajku psorijaze [12]. Ako glifosat uzrokuje pojačanu regulaciju SRSF6 u stanicama raka dojke, to vjerojatno uzrokuje pojačanu tumorigenezu kod izloženih ljudi.

ANT dolazi u nekoliko različitih izoforma s različitim učincima na staničnu biologiju, ali onaj koji je visoko eksprimiran u stanicama raka dojke je ANT2 i pokazao se važnim za održavanje preživljavanja tumora. Posao ANT2 je transport ATP-a u mitohondrije, a ta je aktivnost važna kada stanica radi pod pretpostavkama Warburgovog efekta. Stanice raka proizvode mnogo svog ATP-a u citoplazmi putem glikolize, a zatim ANT2 prenosi ATP u mitohondrije tako da mogu smanjiti količinu ATP-a koju trebaju proizvesti oksidativnom fosforilacijom. Ovo je dobra strategija za zaštitu od oksidativnog oštećenja, osobito kada mitohondriji mogu biti nefunkcionalni zbog mutacija DNK uzrokovanih izlaganjem toksičnim tvarima. ANT2 zapravo programira stanicu za provedbu strategija koje dovode do povećane proliferacije, a ne do apoptoze (stanične smrti) u prisutnosti stresora [13]. Nedavno je postojao interes za razvoj lijekova koji se bore protiv raka suzbijanjem aktivnosti ANT2 [14].

Antoniou i sur. papir može biti značajan napredak u našoj potrazi za postupkom za otkrivanje kontaminacije glifosatom u proteinima. Izvanredno je da su uspjeli identificirati 15 ljudskih proteina za koje se čini da su modificirani supstitucijom glifosata za specifičan ostatak glicina. Rad je od velike vrijednosti za širu zajednicu, jer navodi propisanu proceduru koja se sada može prilično rutinski primijeniti na više drugih tipova stanica uzgojenih u kulturi, kao i na biološkim uzorcima izvađenim iz bolesnih tkiva sisavaca, kao što su nokti oboljelih od skleroderme, stanice kože u bolesnika s psorijazom, uzorci dlake autistične djece, kopita konja oboljelih od osnivača, biopsije tumora, posmrtni Alzheimerov plak, oboljela tkiva bubrega i jetre itd.

Buduće prilike za otkrivanje proteina kontaminiranih glifosatom obiluju, a kako prikupljamo bazu podataka specifičnih uzoraka supstitucije, možda ćemo čak moći predvidjeti pravila za peptidne kontekste u kojima su ostaci glicina posebno osjetljivi, kao na primjer kada su susjedne aminokiseline male (kako bismo spriječili sterična smetnja) ili pozitivno nabijena (da privuče glifosat na mjesto sklapanja peptida zbog njegovog negativnog naboja). Doista, ove vrste pravila već postaju očite u malom skupu pronađenom u Antoniou et al. eksperiment. Nakon šest od 15 navodnih supstituiranih glicina odmah je slijedila pozitivno nabijena aminokiselina (lizin, histidin ili arginin). A deset je odmah prethodio jednom od valina, leucina, serina ili treonina, od kojih su sve male aminokiseline, koje podupiru prostor za metilfosfonilni rep glifosata. Ako glifosat doista zamjenjuje glicin tijekom sinteze proteina, posljedice su zapanjujuće, a podmukli kumulativni toksični učinci glifosata mogu lako objasniti porast koji danas vidimo u prevalenci dugog popisa autoimunih, metaboličkih, neuroloških i onkoloških bolesti.

Reference

[1] MN Antoniou et al. Glyphosate does not substitute for glycine in proteins of actively dividing mammalian cells. BMC Res Notes 2019; 12:494. (Weblink)
[2] A Samsel and S Seneff. Glyphosate, pathways to modern diseases V: Amino acid analogue of glycine in diverse proteins. Journal of Biological Physics and Chemistry 2016; 16: 9-46. (Weblink) (Preuzimanje)
[3] A Zulet et al. Proteolytic Pathways Induced by Herbicides That Inhibit Amino Acid Biosynthesis. PLoS ONE 2013; 8(9): e73847. (Weblink)
[4] S Seneff et al. Does glyphosate acting as a glycine analogue contribute to ALS? J Bioinfo Proteomics Rev 2016: 2(3): 1-21. (Weblink) (Preuzimanje)
[5] A Zuin et al. Ubiquitin signaling: Extreme conservation as a source of diversity. Cells 2014; 3(3): 690-701. (Weblink)
[6] S Gunatilake et al. Glyphosate’s Synergistic Toxicity in Combination with Other Factors as a Cause of Chronic Kidney Disease of Unknown Origin. Int J Environ Res Public Health 2019; 16(15). pii: E2734. (Weblink) (Preuzimanje)
[7] Y Dong et al. Desensitizing plant EPSP synthase to glyphosate: Optimized global sequence context accommodates a glycine-to-alanine change in the active site. J Biol Chem 2019; 294(2): 716-725. (Weblink)
[8] R Bar-Shavit et al. G Protein-Coupled Receptors in Cancer. Int J Mol Sci 2016; 17(8). pii: E1320. (Weblink)
[9] MT Lewis. Homeobox genes in mammary gland development and neoplasia. Breast Cancer Research 2000; 2: 159. (Weblink)
[10] M Cohen-Eliav et al. The splicing factor SRSF6 is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers. J Pathol 2013; 229(4): 630-9. (Weblink)
[11] MA Jensen et al. Splicing factor SRSF6 promotes hyperplasia of sensitized skin. Nat Struct Mol Biol 2014; 21(2): 189197. (Weblink)
[12] H Valdimarsson et al. Psoriasis: a disease of abnormal Keratinocyte proliferation induced by T lymphocytes. Immunol Today 1986; 7(9): 256-9. (Weblink)
[13] SH Baik and J Lee. Adenine nucleotide translocase 2: an emerging player in cancer. J Stem Cell Res Med 2016; 1(2): 66-68. (Weblink)
[14] J-Y Jang et al. Suppression of adenine nucleotide translocase-2 by vector-based siRNA in human breast cancer cells induces apoptosis and inhibits tumor growth in vitro and in vivo. Breast Cancer Research 2008; 10(1): R11. (Weblink)

Zamjenjuje li glifosat glicin u proteinima stanica sisavaca koji se aktivno dijele? autorice Stephanie Seneff ima licencu Creative Commons Attribution 3.0 United States License.